转录组和代谢组联合分析大蒜休眠萌发机制及AsWOX9基因的功能研究

摘要：

大蒜(Allium sativum L.)是百合科葱属的多年生草本植物,栽培历史悠久.大蒜的自然休眠特性对大蒜生产及产品贮藏有重要影响.大蒜休眠萌发的机制有待深入研究,以便合理调控.WOX(WUSCHEL-related homeobox)是一种植物特有的转录因子,在器官的产生,生长和发育过程中起着重要的调控作用. 本研究通过Illumina NovaSeq6000高通量测序和广泛靶向代谢组学测序对休眠期和萌发期的大蒜进行了差异分析.并对其中的差异基因AsWOX9进行了克隆,对该基因的表达和功能进行分析.主要结果如下: (1)利用Illumina NovaSeq6000高通量测序技术对大蒜休眠芽(D)和萌发芽(G)进行测序,得到31230,4846个Clean reads片段和46.84Gb Clean Data.利用BLAST软件将大蒜基因与KEGG,NR,GO,KOG等数据库比较,共包含了32,5492个基因.NR数据库中包含的基因最多,有13,4893个,占总基因的41.44%;KOG数据库包含的基因有8,2809个,占总基因的25.44%.7大数据库中有14,2843个共有基因,占总注释基因的43.89%.通过NR数据库对比,大蒜基因与芦笋基因相似度最高. 在大蒜休眠芽(D)和萌发芽(G)中共有1,0650个差异基因,6924个在萌发期上调表达,3726个在休眠期表达量高.将差异基因比对到GO库中进行富集,生物过程分类中参与染色质组装或分解过程的差异基因最多,有126个,占比2.51%;分子功能分类中具有RNA导向的5'?3'RNA聚合酶活性的差异基因最多,有101个,占比1.77%;在细胞组分分类中参与组成核小体的差异基因最多,有85个,占比1.56%.KEGG富集分析发现,代谢途径,次生代谢产物合成,苯丙烷生物合成,蛋白质合成,碳水化合物代谢,植物激素转导途径上的差异基因数量多且表达显著.植物激素转导途径上有AUX1,GID1,ARR-A,PP2C,AHP,EIN2,EIN3等差异基因. (2)在大蒜休眠芽(D)和萌发芽(G)中共有132个差异代谢物,其中在萌发期含量上升的有129个,含量下降的有3个.脂质,酚酸,黄酮物质在萌发芽中含量上升明显.KEGG富集分析发现,含量有差异的代谢物集中在代谢途径,次生代谢产物合成,苯丙烷生物合成途径上. (3)转录组和代谢组联合KEGG进行富集发现,苯丙烷合成途径富集差异排名第1.差异基因有PAL,4CL,F5H,CoMT,HCT,CAD等,差异代谢物大都属于酚酸类物质.通过通路途径图和相关性分析能够发现基因与代谢物之间的关系,例如PAL的上调表达促进了对香豆酸的积累;CoMT基因的上调表达促进了阿魏酸的积累;HCT(Cluster-21569.47979)基因间接调控对香豆酸,东莨菪内酯,阿魏酸,芥子醇,芥子醛,亚精胺物质的合成.这种分析方法也可以用来研究其它非模式作物. (4)本研究成功克隆了大蒜AsWOX9基因,AsWOX9基因的ORF长度是570bp,编码189个氨基酸.AsWOX9编码的蛋白是亲水性非分泌蛋白,没有信号序列和剪切的位点,序列中有homeobox结构域.AsWOX9与芦笋AoWOX11及水稻OsWOX11同源性较高,属于同一进化分支.RT-qPCR发现,AsWOX9基因在大蒜的多个组织器官部位均有表达,叶中表达量最高.AsWOX9基因的表达受到外源激素ABA和GA激素的诱导. (5)将获得的AsWOX9基因与含有35S启动子的pROKⅡ载体重组,构建了过表达载体pROKⅡ-AsWOX9.在卡那霉素选择压力下,通过冷冻转化方法首先将构建体引入根癌农杆菌GV3101.通过PCR和RT-qPCR验证转基因植物,表明AsWOX9基因已重组到拟南芥基因组中,获得了转基因植物. (6)过表达AsWOX9基因调控了转基因拟南芥植株的萌发和生长.同野生型相比,转基因拟南芥的萌发提前,根系生长变长,叶片数目变多.AsWOX9基因还参与调控了拟南芥激素ABA,GA相关基因ABI3,ABI4,ABI5和RGL2,GID1的表达.同时过表达AsWOX9影响了转基因拟南芥中碳水化合物和蛋白质的代谢.